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抗體選擇和稀釋

更新時間:2012-05-06      點擊次數(shù):6169

對于任何一種給定的目標抗原,都有不止一種有效抗體。為了縮小選擇范圍,實驗中通常要考慮以下幾個方面:

1、分析或者應(yīng)用類型

2、樣品的性質(zhì)

3、樣品的種類

4、抗體宿主的中落淚

5、抗體的標記和檢測

樣品的性質(zhì):根據(jù)樣品的性質(zhì)選擇合適的抗體至少要考慮以下幾個方面

1、要檢測的蛋白區(qū)域。刺激宿主動物產(chǎn)生抗體的抗原物質(zhì)種類繁多,包括全長的蛋白、蛋白片段、多肽、整個生物機體(例如細菌)或細胞。免疫原通常在說明書中會有顯示(但有一些情況抗原是資料,不能公開)。如果要檢測的是一個蛋白片段或全長蛋白的異構(gòu)體或特定區(qū)域,應(yīng)該選擇由該特異片段或區(qū)域或者包含該特異片段或區(qū)域所制備的抗體。如果要通過FACS去檢測活細胞表面蛋白,則要選擇由胞外區(qū)蛋白抗原制備的抗體。

2、樣品的處理工藝。有些抗體要求樣品先進行特殊處理。例如,許多抗體只識別降解或變性蛋白,可能因為這樣可 暴露藏在二次或三次折疊后蛋白內(nèi)部的抗原表位。另一方面,有些抗體卻只能識別自然折疊狀態(tài)蛋白上的表位。(Abcam公司用于western blotting的抗體,樣品都需進行降解和變性處理,除非在說明書中特別標明)。當搜尋用于免疫組化的抗體時,則應(yīng)注意有些抗體只適合用于未固定冷凍組織。有時,抗原修復(fù)步驟則*,這樣可以消除由福爾馬林固定所引起的交聯(lián),因為有些抗體不能結(jié)合福爾馬林固定和石蠟包埋組織中的目標抗原。上述限制會在說明書的應(yīng)用章節(jié)中明確標出。

樣品的種類

盡管由于具有足夠多的同源氨基酸序列,抗體有可能和其它物種的同一靶蛋白反應(yīng),但是我們選擇抗體時仍然應(yīng)該選擇來源于同一物種的抗原。如果樣品不是來自于列表所示的物種之一,不能說明該抗體不可以用來檢測這種樣品,但是來自該物種的樣品未被檢測過,因此我們很難推薦它的適用性。根據(jù)序列相似性可以預(yù)測交叉反應(yīng)性,值得驕傲的是Abcam在說明書里有ExPASy和NCBI  BLAST的鏈接,可以比對不同物種來源氨基酸序列的同源性。

選擇一抗宿主的類別

一般來說,當用標記二抗來檢測非標記一抗時,產(chǎn)生一抗的宿主動物的類別就非常重要。對于免疫組化,產(chǎn)生一抗的宿主應(yīng)盡可能和樣品的宿主種類不同,以避免二抗的免疫球蛋白與樣品中內(nèi)在的免疫球蛋白發(fā)生潛在的交叉反應(yīng)。例如,用于檢測鼠源蛋白的一抗就不應(yīng)來源于小鼠或大鼠,選用來源于兔的一抗和抗兔的標記lgG二抗進行檢測,會比較合適。如一抗已直接附有標記,則可避免上述交叉反應(yīng)發(fā)生。對于不含內(nèi)源性免疫球蛋白樣品的檢測,宿主的種類選擇不用很嚴格。例如進行western blotting的細胞裂解液就被認為不包含lgG會以50和25kDa的條帶出現(xiàn)在在降解和變性樣品中,分別相當于lgG分子的重鏈和輕鏈。

選擇二抗

二抗應(yīng)來源于一抗的物種。舉例來說,如果您的一抗來源于鼠,那么二抗也就應(yīng)該選擇抗鼠的。我們建議仔細核對二抗說明書以確定您要使用的二抗經(jīng)過測試可用于您的實驗。Abcam提供有大量標記各種熒光物質(zhì)和染色物質(zhì)的二抗。檢查您所用的一抗數(shù)據(jù)表的底部,將會顯示一些合適的二抗。

雙重染色體的選擇

對培養(yǎng)細胞或組織進行雙免疫染色要求非標記一抗來源于不同物種的動物,而二抗則特異性識別其中一種一抗。二抗如果與其它動物來源的免疫球蛋白有交叉吸附,則會再說明書中明確說明。

熒光和染料標簽:標簽抗體的目的是要看到抗體結(jié)合的信息。標簽的選擇依據(jù)以下幾個方面

1、檢測方法:英冠或有色沉淀。英冠標簽會再特定波長的光激發(fā)下發(fā)光。有多重?zé)晒饪晒┻x用,不同熒光標簽有*的吸收和激發(fā)波長。在結(jié)合了合適的底物時,酶標簽HRP和AP可以形成有色沉淀。

2、封固劑(只限免疫組化):AEC、Fast Red、INT或是其它的水溶性染色劑均溶于酒精,因此要求使用水溶性封固劑。一上提到的其它有機物要想得到較好的折射率,使用有機封固劑封固。熒光素標簽需要水溶性封固劑。膽藻素蛋白(藻青蛋白/藻紅蛋白)需要不加甘油的水溶性封固劑,否則會產(chǎn)生淬滅效應(yīng)。

3、生物素標記的抗體對于信號的放大是很有效的,比如可應(yīng)用于親和素-生物素-酶或熒光復(fù)合物(通??s寫為ABC試劑)或者親和素或鏈霉親和素結(jié)合酶或熒光染料檢測法。

未純化抗體的稀釋和濃縮

未純化抗體中的目標抗體濃度有很大的差異。如果不清楚未純化抗體樣品的濃度,就可以參考下面的“特殊范圍”作為估計的指導(dǎo)。

 

組織培養(yǎng)上清

腹水

全抗血清

全抗血清純化的抗體

WB/斑點雜交

1/100

1/1000

1/500

1ug/ml

IHC/ICC

Neat to 1/10

1/100

1/50-1/100

5ug/ml

EIA/ELISA

1/1000

1/10000

1/500

0.1ug/ml

FACS/流式細胞術(shù)

1/100

1/1000

1/500

1ug/ml

IP

1/100

1/50-1/100

1-10ug/ml

濃度估計

1-3mg/ml

5-10mg/ml

1-10mg/ml

 

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